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本制品是一种基于MitoTracker Red CMXRos荧光探针的，用于3D培养的细胞球或类器官等的活细胞线粒体染色和线粒体膜电位检测的溶液。仅需染色10分钟就可在荧光显微镜下观察到非常明亮的活细胞线粒体红色荧光染色。

本制品是一种氧化型的红色荧光染料，只需简单地和细胞孵育，即可通过被动运输穿过细胞膜，并借助本探针含有的弱巯基反应性的氯甲基官能团特异性地标记有生物活性的线粒体。本探针含有的弱巯基反应性的氯甲基，可以和线粒体内蛋白的巯基反应并共价连接，因此后续实验使用多聚甲醛或甲醛等醛类固定剂，以及细胞通透的去垢剂Triton X-100等处理时，线粒体的荧光标记不会消失，但可能会有一定程度的下降(约下降2～10倍)。由于本荧光探针的激发光谱和发射光谱与常见的绿色荧光探针重叠较少，因此非常适合用于荧光双标实验。

由于Mito-Tracker Red CMXRos在线粒体内的聚集依赖于线粒体的膜电位，因此本制品也可以作为线粒体膜电位的指示探针，通过检测线粒体膜电位的变化来检测细胞凋亡。

MitoTracker Red CMXRos是一种具有细胞通透性的X-rosamine衍生物(Chloromethyl-X-rosamine，简称CMXRos)，能够特异性地标记细胞中具有生物活性的线粒体，检测线粒体膜电位。本制品为高纯度探针，兼容后续的细胞固定和通透，但染色后再固定和通透，荧光强度会有一定程度的下降。

Mito-Tracker Red CMXRos可以用作线粒体特异性的荧光探针。和Rhodamine 123或JC-1相似，Mito-Tracker Red CMXRos对于线粒体的染色依赖于线粒体膜电位，因此该探针只能对活的细胞或组织进行染色，不能对固定或通透后的细胞或组织进行染色。

• 适用范围广：本制品可用于各种方法培养出的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。
  
• 使用便捷：整个检测过程仅需约10～30分钟即可完成。对于常规的3D细胞活细胞染色，仅需加入本制品避光孵育10分钟即可进行荧光检测。

组分	500T	2500T
By3D Mito-Tracker Red CMXRos染色液(1000×)	50μL	250μL
说明书	1份	1份

保存：-20℃，避光，有效期1年。

• 细胞球在外力的作用下容易变形或分散，PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
  
• Mito-Tracker Red CMXRos (线粒体红色荧光探针)可以用于活细胞的线粒体荧光染色，不适合用于固定后细胞或者组织的染色；但在用本制品标记线粒体后，后续可以进行固定和通透，并用其它探针进行染色或进行免疫荧光染色，但染色后再固定和通透，荧光强度会有一定的下降。而且不同的细胞，固定和通透的影响会有所区别，建议对固定和通透试剂、条件进行一定的测试。
  
• 本制品浓度经过百奥莱博的优化，确保可以满足活细胞染色及各种常规染色的需要。如需使用特定浓度的Mito-Tracker Red CMXRos，请选购Mito-Tracker Red CMXRos。
  
• 染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽量当天完成检测。

本步骤以96孔板，每孔接种100μL细胞为例，如使用其它类型的多孔板，各试剂使用量请按照相应比例进行换算。

• 3D细胞的准备：在96孔3D培养板中每孔接种100μL细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，按照3D细胞培养方案培养细胞，并按照实验设计进行一定的处理。96孔3D培养板推荐使用3D细胞培养板包被液、3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板，或直接使用GoldBalb超低吸附96孔板(YTC4962或YTC4961)、超低吸附黑色透明底96孔板等。
  
  • 为达到最佳的使用效果，具体细胞球培养时间、药物等干预时间可以根据细胞种类、具体的实验需求等进行调整。例如，对于HCT-116细胞，通常接种培养48小时形成较为紧实的细胞球后进行干预染色效果较好。
• 3D细胞Mito-Tracker Red CMXRos染色：
  
  • By3D Mito-Tracker Red CMXRos染色液(1×)的配制：如下表所示，按照96孔板每孔需要100μL By3D Mito-Tracker Red CMXRos染色液(1×)的量，用PBS稀释配制适量的By3D Mito-Tracker Red CMXRos染色液(1×)。PBS推荐使用PBS。
    

    样品数	10个样品	50个样品	100个样品
    PBS	1mL	5mL	10mL
    By3D Mito-Tracker Red CMXRos染色液(1000×)	1μL	5μL	10μL
    总体积	~1mL	~5mL	~10mL

    • 配制好的By3D Mito-Tracker Red CMXRos染色液(1×)必须一次使用完毕，不能冻存。
    • By3D Mito-Tracker Red CMXRos染色工作液中的Mito-Tracker Red CMXRos的最终浓度可以根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。Mito-Tracker Red CMXRos的工作浓度通常为0.5～2×，推荐使用浓度为1×。
  • 小心去除原有细胞培养液。每孔加入100μL By3D Mito-Tracker Red CMXRos染色液(1×)，在适宜于细胞培养的温度避光孵育10分钟。
    
    • 为达到最佳的染色效果，具体染色时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状大小等进行调整。
    • 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。3D细胞球通常沉浮在培养板或培养皿等培养器的底部，培养板在对着光线时能看到孔内针尖大小的乳白色细胞球，吸除孔内液体时须尽量避开细胞球以免将细胞球吸走。可以根据孔内液体的体积将移液器调至合适的量程，例如需要吸除的液体体积为100μL，将200μL移液器的量程调整到50～70μL，避开细胞球从液体边缘缓慢、分次吸除。孔内加入液体时，沿着孔壁小心、缓慢加入，避免破坏或吹散3D细胞球。
• 荧光拍摄：染色结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并用完全培养基换液以终止染色，即可在荧光显微镜下观察。Mito-Tracker Red CMXRos为红色荧光探针，最大激发波长为579nm，最大发射波长为599nm。
  
  • 任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。

图1.3D培养活细胞线粒体染色液(Mito-Tracker Red CMXRos)对于3D培养的HCT-116细胞的染色效果图。5000个HCT-116细胞使用3D细胞培养包被试剂盒包被的U形底96孔板培养72小时，然后吸除培养液后直接加入By3D Mito-Tracker Red CMXRos染色液(1×)染色10分钟(图中两种染料可混合配制后使用)。结果显示，By3D Mito-Tracker Red CMXRos对于3D细胞染色效果清晰、明亮，By3D Mito-Tracker Red CMXRos染色的线粒体呈现红色荧光(图B)，3D细胞Hoechst 33342染色液染色的细胞核呈现蓝色荧光(图C)，红色荧光及细胞核蓝色荧光的叠加(Merge)效果见图(图D)。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

传统的细胞培养大多以二维(2D)的形式展开，但2D培养的细胞在生长方式、生长形态、分化和功能等方面都与体内生理条件下细胞的真实形态和结构存在明显差异，可能会因为细胞结构和组织形态的缺失，使实验结果的可信度降低。三维(3D)细胞培养能够更好地模拟体内细胞生存的微环境，更能代表体内组织，也能更真实的反映细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用，细胞对外源性和内源性刺激的应答也更接近于它们在体内的反应，3D细胞培养从而成为更有价值并更为可信的体外实验模型，能够获得与体内实验更加一致的实验结果。

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